smok สารสกัดควันของบุหรี่ (CSE) ทำขึ้นจากที่ชี้แจง

smok

การเตรียมสารสกัด smok จากควันจากบุหรี่
สารสกัดควันของบุหรี่ (CSE) ทำขึ้นจากที่ชี้แจงไว้ก่อนหน้านี้ที่ผ่านมา 7 อย่างสังเขป ยาสูบศึกษาค้นคว้า 3R4F ในเมืองเคนตักกี้ (University of Kentucky, Kentucky, USA) ถูกเพิ่มฟองผ่านของกินเลี้ยงเชื้อ

 RPMI-1640 ที่เสริมด้วย 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin และก็ 100 μg/mL streptomycin โดยใช้ Watson-Marlow 520R peristaltic ปั๊ม. หลังจากนั้นก็เลยเพิ่มเติม FCS 10 % แล้วก็ CSE ถูกกรองโดยใช้ตัวกรอง 0.22 ไมครอนที่ขับเคลื่อนด้วยหลอดฉีดยา ต่อจากนั้น CSE ถูกปรับไปยัง OD ที่อยากโดยใช้ของกินเลี้ยงเชื้อ

การแยกนิว smok โทรฟิลรวมทั้งการเพาะเลี้ยง
นิวโทรฟิลถูกแยกออกมาจากเลือดส่วนปลาย ผสมเลือดครบส่วนกับเดกซ์แทรน 4% (สิกข์มา-อัลดริช) ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) 1 × แล้วก็ PBS ในอัตราส่วน 2:1:1 แล้วก็เซลล์เม็ดเลือดแดงถูก

ปลดปล่อยให้นอนก้นบนน้ำแข็งตรงเวลา 30 นาที ส่วนลอยเหนือขี้ตะกอนที่เหลือจะถูกลบออก วางทับ Ficoll-Paque (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) แล้วก็ปั่นแยก (400 กรัมตรงเวลา 30 นาทีที่

อุณหภูมิปกติ) เซลล์เม็ดเลือดแดงที่เหลือถูกสลายโดยการเติมน้ำระดับโมเลกุลที่ไม่มีเชื้อ (Sigma-Aldrich) แล้วก็สารแขวนลอยถูกยับยั้งโดยการเติม PBS ต่อจากนั้น สารแขวนลอยถูกล้าง (400  กรัมตรง

เวลา 10 นาทีที่ 4 °C) และก็ปริมาณมึงรนูโลไซต์ถูกประเมินโดยการละเว้นทริปแพนบลู มึงรนูโลไซต์ถูกยับยั้งอีกรอบที่ความหนาแน่น 1 × 10 6ต่อมิลลิลิตรในสื่อเสริม RPMI-1640 ความบริสุทธิ์ของการเต

รียมนิวโทรฟิลอยู่ที่ราว 95 % (การันตีโดยการย้อมสี Rapi-diff ดังที่ชี้แจงไว้ที่ผ่านมา 32 ) การเตรียม Cytospin ถูกทำให้แห้งกลางอากาศ ปรับปรุงด้วยเมทานอลตรงเวลาสิบนาที รวมทั้งย้อมด้วย Rapi-diff ตามคำแนะนำของผู้สร้าง (Triangle, Skelmersdale, UK) นับรวม 200 เซลล์ต่อสไลด์และก็คำนวณรูปทรงของนิวโทรฟิล

ความเคลื่อนไหวรูปร่างของนิวโทรฟิล ความมีชีวิต แล้วก็การแสดงออกของ CD11b แล้วก็ CD66b
นิวโทรฟิลถูกเพาะที่ 5 × 10 5เซลล์ต่อหลอดโพลีโพรพิลีนแล้วก็บ่มด้วย ECVE (0.001

–0.1 OD) ตรงเวลา 2, 4 หรือ 6 ชั่วโมง (ความเคลื่อนไหวรูปร่างรวมทั้งการแสดงออกของ CD11b แล้วก็ CD66b) หรือ 6 ชั่วโมง (การมีชีวิต) ใน 5 % CO 2ความชุ่มชื้นในบรรยากาศ 37 °C เซลล์ถูกล้างใน PBS และก็ตระเตรียมสำหรับโฟลว์ไซโตเมโทรี เนื้อหาอยู่ในไฟล์เพิ่มเติมอีก3

MMP-9 รวมทั้ง CXCL8 เปิดตัว
นิวโทรฟิลถูกเพาะที่ 1 × 10 5เซลล์ต่อหลุมในจาน 96 หลุมตูดแบนและก็ฟักด้วย ECVE, CSE (0.001–0.1 OD) หรืออะโครลีน (สิกข์มา-อัลดริช) ตรงเวลา 6 ชั่วโมงในบรรยากาศความชุ่มชื้น CO 2 5% ที่ 37 องศาเซลเซียส ส่วนลอยเหนือขี้ตะกอนถูกนำออกรวมทั้งพินิจพิจารณาสำหรับ MMP-9 และก็ CXCL8 โดยการทดลอ

งด้วยโปรตีนที่ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาเคมีที่เชื่อมโยง immunosorbant (ELISA; R&D Systems, Abingdon, UK) ตามคำแนะนำของผู้สร้าง สารเหนือขี้ตะกอนยังคงใช้เพื่อวัดกิจกรรมของ MMP-9 โดยไซโมกราฟฟีและก็ระดับ MMP-9 โดย western blot เนื้อหาอยู่ในไฟล์เสริมเติม3

สำหรับเพื่อการศึกษาเล่าเรียนที่ตรวจตราผลการบำบัดรักษาด้วยยาต่อการปลดปล่อย MMP-9 ที่รั้งนำโดย ECVE (0.003 OD) นิวโทรฟิลถูกบำบัดรักษาล่วงหน้าด้วยการควบคุมด้วยกระสายยา (DMSO 0.005%) ตัวยับยั้ง p38 MAPK BIRB-796 (1 ไมโครโมลาร์; Sigma-Aldrich) ERK 1/2 inhibitor selumetinib (1 μM; S

tratech Scientific Ltd, Newmarket, UK) หรือ dexamethasone (1 μM; Sigma-Aldrich) ตรงเวลา 1 ชั่วโมงก่อนฟักตัวด้วย ECVE MMP-9 ถูกวัดโดย ELISA

กิจกรรม NE
นิวโทรฟิลถูกเพาะที่ 1.4 × 10 5เซลล์ต่อหลุมในจาน 96 หลุมตูดแบนรวมทั้งบ่มด้วย ECVE (0.001–0.1 OD) ตรงเวลา 6 ชั่วโมงในบรรยากาศความชุ่มชื้น CO 2 5% ที่ 37 °C ดูดซับสเตรตที่มีโรดามี

น 110 เป็นหลักฐาน (R6506 Invitrogen) ถูกเพิ่มเติมก่อนจุดจบ 30 นาทีภายหลังที่วัดการเรืองแสงโดยใช้เครื่องอ่านเพลตโอเมก้า FLUOstar ที่การปลดปล่อย 485 นาโนเมตร 520 นาโนเมตร (BMG Labtech, Buckinghamshire, UK)